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摘要：对采自贵州省兴义市的华西雨蛙（Hyla gongshanensis）标本进行了线粒体16S rRNA基因扩增，并用双重单系法分析构建了华西雨蛙各种群的系统发育树。结果表明，该标本属华西雨蛙，群内部分化为兴义支系、云南曲靖支系和越南沙巴支系，而3个支系间相互聚类关系有待进一步深入研究。
关键词：华西雨蛙（Hyla gongshanensis）；16S rRNA基因；克隆；分子鉴定
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）19-4865-03
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.055
Abstract： The mitochondrial 16S rRNA of two Hyla gongshanensis samples from Xinyi city in Guizhou province was amplified and sequenced，the phylogenetic trees of various groups of H. gongshanensis was constructed using double monophyletic analyse. The results showed that this specimen was belonged to H. gongshanensis. H. gongshanensis recovered 3 lineages，including the Xinyi lineage， the Quqing lineage and the Sabah （Viet Nam） lineage， but the relationship among the three lineages was still uesolved.
Key words： Hyla gongshanensis； 16S rRNA gene； cloning； molecular identification
华西雨蛙（Hyla gongshanensis）隶属于雨蛙科（Hylidae）雨蛙属（Hyla），广泛分布于中国四川、云南、贵州、湖南、广西、广东等地及印度和缅甸[1]。各地方种群间存在一定的形态差异，进一步将其分成5个亚种[2，3]，即指名亚种、川西亚种、景东亚种、腾冲亚种和武陵亚种。贵州省境内主要分布有景东亚种和武陵亚种两个亚种，景东亚种主要分布于贵州省西部，武陵亚种主要分布于贵州省东北部。近年来，由于人为的农田耕作环境的改变以及农药化肥的大量使用，种群数量大量减少，需要加强保护。
本研究利用华西雨蛙线粒体16S rRNA与其他华西雨蛙亚种同源基因进行相似性比较并构建系统发育树，对华西雨蛙各地方种群间的系统发育关系进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 试验材料
华西雨蛙标本于2014年6月23～25日采自贵州省兴义市下五屯镇，2个成体（标本号：LPSXY2014062308；LPSXY2014062501），保存于六盘水师范学院生命科学系标本馆。
1.2 目的基因片段的扩增和序列测定
DNA模板的提取方法参照熊荣川等[4]的方法，扩增引物为1对两栖动物通用的线粒体16S rRNA片段扩增引物P7/P8[5]，P7为上游引物：5’-CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3’；P8为下游引物：5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’。PCR反应体系为：2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，总DNA模板2 μL（含10～100 ng），上、下游引物各2 μL（10 μmol/L），ddH2O补至50 μL。 PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.3 系统发育分析
根据双重单系法，对两组16S rRNA基因数据进行系统发育分析。所测得的华西雨蛙16S rRNA基因序列经过Blast比对获得100条初步的参考序列，与待定基因序列一起构成数据集A；经过双重单系法的筛选，得到5条系统发育关系较近的16S rRNA序列并与待定基因序列一起构成数据集B（表1）。
对于数据集A，进行系统发育分析时不预先设定外群，构建无根系统发育树。用MUSCLE[10]程序对序列进行比对，辅以人工校对。在jModelTest 2中筛选最适合该数据集序列演化模型以供最大似然法（Maximum likelihood，ML）分析。根据AIC标准，适合本数据集的模型为GTR+G+I，其中G=0.436，I= 0.487。使用FastTree[11]构建最大似然树（ML tree）。ML树支持率大于70%，表明该支系关系得到充分解决；在50%～70%之间为弱支持，否则视为未解决[12]。
对于数据集B，以中国雨蛙作为外群，用ClustalW[13]程序对序列进行比对，辅以人工校对。为了对待定基因的系统发育地位进行更准确判断，对数据集B同时进行最大似然法分析和贝叶斯分析。在jModelTest 2中筛选最适合该数据集序列演化模型以供最大似然法分析。根据AIC标准，适合本数据集的模型为GTR+G，其中G=0.32。使用MEGA6.0[14]构建最大似然树；以无根的邻接树为搜索起始树，非参数自展抽样次数设置为1 000。支持率大于70%，表明该支系关系得到充分解决；在50%～70%之间为弱支持，否则视为未解决[12]。
贝叶斯分析采用MrBayes 3.2[15]软件，碱基替换模型设置为GTR+G+I。起始树设为随机树，马尔科夫链的蒙特卡洛方法设置为4条链同时运行1×106代，3条热链1条冷链。每1 000代对系统树进行抽样，最终得到1 000棵系统发育树。将前250棵树舍弃后，根据剩余的样本构建一致树（Consensus tree），并计算相关参数。以后验概率（Posterior probability，PP）来表示各分支的可信度（支持率），贝叶斯后验概率大于等于95%说明其支系支持率得到充分解决[16]。
1.4 遗传距离的计算
选用MEGA6.0[14]分析数据集B中各序列间差异，依据Kimura2-parameter模型计算两两序列间的遗传距离以及主要支系间的平均遗传距离。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增及测序结果
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得600 bp左右的基因片段。经双向测序并拼接，获得长度分别为547 bp，核苷酸序列（GenBank登录号：KP123603、KP123604），序列碱基组成存在明显的偏向性：AT含量较高，GC含量较低。
2.2 系统发育分析结果
将所测得华西雨蛙16S rRNA基因序列进行搜索比对，其与GenBank中的已有华西雨蛙序列相似度最高，搜索得到的100条同源序列与KP123603、KP123604构成16S rRNA序列数据集A。基于数据集A构建的系统发育树中（图1），KP123603、KP123604与3条华西雨蛙同源序列聚为一个单系（华西雨蛙支系）。在其内部，KP123603、KP123604以较低的最大似然率独立为一个支系（图1），进一步与云南曲靖种群16S rRNA基因序列（KM271781）以及一未知序列（JQ621934）构成单系，而该单系与越南种群构成的华西雨蛙支系并没有得到较高的最大似然支持率。
经过双重单系法筛选得到5条近缘16S rRNA序列与KP123603、KP123604构成数据集B（表2），使用最大似然法及贝叶斯法构建系统进化树（图2）。结果表明，内群由3个支系构成，其中贵州兴义为一个独立支系且支持率较高，与云南曲靖支系互为姊妹群但是支持率并不高，另外越南沙巴种群独立为一个支系。
2.3 遗传距离
基于16S rRNA序列的遗传距离（表2）表明，贵州兴义华西雨蛙与越南种群的遗传距离最近（0.004），内群各序列间的遗传距离为0.008（0.000～0.012），内外群间遗传距离为0.030（0.023～0.036）。
3 小结与讨论
华西雨蛙因其各地方种群间存在一定形态差异而被学者划分为5个不同的亚种[2，3]，即指名亚种、川西亚种、景东亚种、腾冲亚种和武陵亚种。随着现代DNA测序技术以及生物信息学技术的发展，利用特定DNA片段对生物进行种类鉴定，已经成为深入认识生物种分类地位及种间亲缘关系的一个重要手段，尤其是对于那些一直存在分类争议的动物类群。本研究成功扩增了贵州兴义华西雨蛙的线粒体16S rRNA基因，经过系统发育分析，其与华西雨蛙云南曲靖及越南沙巴的两个种群聚为一个单系，因此应该属于华西雨蛙。
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